罗非鱼链球菌病病原鉴定及中草药药敏试验

摘要：从广东省肇庆、广州、番禺三个地区发病罗非鱼肝、肾、脑中分离出3株海豚链球菌。中草药药敏试验显示，茵陈蒿散、黄连解毒散、黄连解毒散改方、三黄散、黄连有良好的抑菌效果。

随着罗非鱼养殖业的迅猛发展，近年在广东、海南、福建、广西等省的养殖罗非鱼中暴发一种流行病—链球菌病，无论是网箱，还是池塘养殖的罗非鱼，都有此病的发生，主要危害亲鱼及100克以上的幼鱼和成鱼。罗非鱼链球菌病是一种暴发性流行病，主要病理特征为眼球突出或混浊发白，眼眶充血，腹部膨大，肛门红肿，采食减少或绝食，游姿平衡失调，翻滚，转圈，解剖病鱼可见胆囊肿大，胆汁稀薄，色浅，肠腔充满淡黄色液体，肝脏增大。

近期，华南地区养殖罗非鱼出现链球菌病，其发病面积之广，危害程度之重很快成为业内关注的焦点，无论是罗非鱼饲料经销商、罗非鱼出口企业还是政府相关部门都表示了高度的重视。本文对广东省部分地区发病鱼体中进行罗非鱼链球菌病原进行分离鉴定及中药药敏试验，为该病的防治提供试验依据。

关键词：院链球菌中草药病原

1材料与方法

1.1病料
来自广东省肇庆、广州、番禺三个地区罗非鱼养殖场。

1.2试验材料
营养琼脂培养基、血平板培养基（广东环凯微生物科技有限公司），细菌生化鉴定管（杭州天和微生物试剂有限公司），大黄、板蓝根、黄芪、淫羊藿、茵陈、栀子、黄连、黄芩、黄柏、金银花、野菊花、紫花地丁各、蒲公英、天葵子、白头翁、秦皮、鱼腥草、乌梅、五倍子、甘草及黄连等购买于广州市中药市场。

1.3病原分离和形态观察
以无菌方法分别从发病鱼的肝、肾、脑等部位取一小块组织置于营养琼脂培养基平板划线接菌，于28℃培养24～48小时，挑取单个菌落进行纯培养。按常规方法对分纯菌株进行革兰氏染色、镜检以及溶血试验。

1.4生理生化试验
取分纯细菌，分别接种于各生化培养管中，28℃培养48h，每天观察生化管颜色变化。

1.5中药药敏试验
1.5.1中药的制备
将中草药烘干后,按组方比例分别称取各药成分，每组药方共50克，按1：10比例加水煎煮3次，每次煮沸30min，集中3次煮出的药液进一步煎煮浓缩至100ml，即每毫升约含原生药0.5克，高压灭菌，于4℃冰箱中保存备用。各种药物浓度为中药干重占药液总体积的百分比（W/V）表示。
1.5.2药敏纸片的制备
选用新华1号定性滤纸，用打孔机打成直径为6mm的小圆纸片，根据需要将数片放入培养皿后包好，在121℃灭菌20min，置100℃干燥箱内烘干备用。将灭菌滤纸片用无菌镊子摊布于灭菌培养皿中，以每110张滤纸片吸收药液lml计，每张滤纸片饱含吸水量为0.009ml，不时翻动，使滤纸将药液均匀吸净，一般浸泡30min即可，同时设对照纸片，用灭菌生理盐水制备。然后取出含药纸片置于一纱布袋中，以真空抽气使之干燥。干燥后立即装入无菌小瓶中加塞，置于干燥器内或冰箱冰冻层中保存备用。
1.5.3药敏试纸平板的制备
采用药敏纸片琼脂平板扩散法。细菌纯化培养后，用灭菌生理盐水洗下菌苔，离心清洗3次，然后校正菌液浓度至108个/ml。将待检菌液各取0.2ml在普通琼脂平板上均匀涂抹，加盖后放置5min，用镊子将药敏纸片平放在平板上，并轻压使其紧贴在平板表面，两纸片中心相距不少于24mm，纸片与平皿边缘不少于15mm。于28℃培养24h，观察结果，每个处理设4个重复。
抑菌效果判定：抑菌圈直径≥20mm为极敏，用“＋＋＋”表示；15-19mm为高敏，用“＋＋”表示；10-14mm为中敏，用“＋”表示；10mm以下为低敏，用“－”表示。

2试验结果

2.1病原菌的分离提纯及镜检结果
经多次纯化分离后，得到3株细菌：普通营养琼脂平板上为隆起、不透明的小菌落；在血平板上，可观察到无色透明的溶血环，均呈β溶血；革兰氏染色阳性；菌体均为圆形、单个、两个或多个链球状排列。
2.2生理生化鉴定结果
3株细菌的生理生化反应结果一致：发酵葡萄糖、麦芽糖、山梨糖、半乳糖、蜜二糖、棉子糖、果糖、纤维二糖、甘露糖、蔗糖、蕈糖；不发酵侧金盏花醇、七叶苷、阿拉伯糖、卫茅醇、山梨醇、木糖、菊糖；吡咯酮芳氨酶（PYR）呈阳性反应；V-P阴性、精氨酸酶阳性、赖氨酸酶阴性、不分解淀粉。根据《伯杰氏细菌鉴定手册》(第9版)中对链球菌的描述，初步鉴定此3株菌均为海豚链球菌(streptococcusiniae)。
2.3药敏试验结果
24h培养后取出检查，用标尺度量各个平板出现的抑菌圈，并记录结果。试验结果表明，对照纸片无抑菌圈出现；茵陈蒿散、黄连解毒散、黄连解毒散改方、三黄散、黄连素为中敏，表现出良好的抑菌效果。其余各组中药的抑菌圈直径均在10mm以下为低敏，抑菌效果不明显，具体结果见表1。